as溶于水吗_ABTS溶液需要现配现用吗

1.有谁对ELISA试剂盒了解

2.自由基清除能力如何用Trolox等价抗氧化能力表示

3.as溶于正己烷吗

4.如何设计一种检测动物或植物中某的免疫学方法(只有已知的该标准抗原)

ELISA实验中是以抗原和抗体的免疫反应为基础，ELISA试剂以及各种溶液如何配置?最近刚做了下ELISA实验，把各种ELISA配置方法汇总如下：(1)　ELISA实验包被缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(3)　ELISA实验稀释液;(4)ELISA实验终止液(5)ELISA底物缓冲液(6)ELISA实验TMB(四甲基联苯胺)使用液(7)　ELISA实验ABTS使用液(8)ELISC。

人miRNA /人microRNA: ://product.bio1000/101595/ 生物帮上面有这方面的资料。

有谁对ELISA试剂盒了解

酶联免疫法

简介

酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。　它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。

步骤

ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。

基本原理

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。　②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：　①固相的抗原或抗体　②酶标记的抗原或抗体　③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

编辑本段双抗体夹心法测定抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 双抗体夹心法

一

将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二

加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

三

加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

四

加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。　在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。　使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。　双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出阳性反应。用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。　双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

编辑本段双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

编辑本段双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现阴性结果。

编辑本段间接法测抗体

间接法

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。　间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。　间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

编辑本段竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。　⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。　当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般用此法。

编辑本段捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：　⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

编辑本段应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

编辑本段ELISA的试剂

在临床检验中一般用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：　⑴已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； ELISA试剂

⑵酶标记的抗原或抗体（结合物）；　⑶酶的底物；　⑷阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；　⑸酶联物（结合物）及标本的稀释液；　⑹洗涤液；　⑺酶反应终止液。

注意事项

⒈　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可用羊血清、兔血清或BSA等封闭。　⒉　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：　⑴　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　⑵ 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。　⑶　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。　⑷　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

自由基清除能力如何用Trolox等价抗氧化能力表示

（一）ELISA测定技术的发展

然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。 一、Elisa试剂盒测定技术的发展 临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。 1、基因工程试剂对免疫测定技术 发展的影响 免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。 HBsAg试剂特点（检测模式：临 床抗体夹心法）： 包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。 酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。 可测得HBsAg变异样品。 提高检测的特异性（99.98%） 提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml elisa试剂盒的用途 测试剂盒检测原理 ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒 的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性

[编辑本段]（二） 操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二 用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 ↓ 加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照） ↓ 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml， 37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 ↓ 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

[编辑本段]（三） 试剂器材

1. 试剂 （1） 包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）: NaHCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml （2） 洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml （3） 稀释液： 牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 （4） 终止液（2M H2SO4）： 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。 （5） 底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）: 0.2MNa2HPO4（28.4克／L）25.7ml 0.1M柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸馏水50ml。 （6） TMB（四甲基联苯胺）使用液: TMB（10mg／5ml无水乙醇）0.5ml 底物缓冲液（PH5.5） 10ml 0.75％H2O2 32μl （7） ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl （8） 抗原、抗体和酶标记抗体。 （9） 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: （1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 （2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 （3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。

as溶于正己烷吗

1)ABTS+.自由基清除能力的测定

ABTS+.自由基的制备：

将7mmol／L ABTS储备液和2．45mmol／L高硫酸钾(最终浓度)混合，在室温、避光的条件下静置过夜，形成ABTS”自由基储备液。使用前用O．1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)稀释成工作液，使其在734nnl处的吸光值为O．70-O．02。

绘制标准曲线：

配制一系列浓度的Trolox溶液(0—3mmol／L)。20uL不同浓度的Trolox溶液与2mLABTS+.工作液混合，反应6min后在734nm读取吸光值，以Trolox溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线

ABTS+.自由基清除能力测定：

20uL消化液与2 mLABTS+.工作液混合，反应6min后在734 nln读取吸光值。ABTS+.自由基清除能力用Trolox等价抗氧化能力表示(TEAC，umol／L)。

请问下各位大侠，ABTS+.自由基清除能力如何用Trolox等价抗氧化能力表示。最好举个例子，

如何设计一种检测动物或植物中某的免疫学方法(只有已知的该标准抗原)

ABTS使用广泛间接检测用于亲水性亲脂性物质抗氧化能力测定ABTs经氧化稳定蓝绿色阳离自由基ABTs+·能溶于水相或酸性乙醇介质414、645、734815nm处吸收测物质加入ABTS+·溶液所含抗氧化能与ABTs+·发反应使反应体系褪色ABTs+·吸收波(般选择734nm)检测吸光度变化

具体也可以自己查阅资料

不懂可以追问.

这个得具体问题具体分析。看你想达到什么检测目的了，另外还得看是什么，存在于动植物什么部位。最简单的就是沉积实验：用标准抗原免疫鼠或兔等使其产生抗体，再用其血清作个沉积实验就可以了。这个实验不敏感，需要抗原抗体量较大，如果是特殊或是感染初期，则检测不到。如果你有条件的话可以做ELISA，这个实验敏感性强。

一,基本原理

它用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.

在这种测定方法中有3种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)

②酶标记的抗原或抗体(标记物)

③酶作用的底物(显色剂)

测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,

再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色.

其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比.

这种有色产物可用肉眼,光学显微镜,电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定.

其方法简单,方便讯速,特异性强.

二,酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物.是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物 ,将得到不同的颜色反应.

360,450

420

荧光

**

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)

β-D-半乳糖苷酶

405

420

**

深蓝色

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰

葡萄糖氧化酶

400

500

**

红色

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐

碱性磷酸酯酶

492

460

449

425

642

橘红色

**

棕色

兰色

蓝绿色

邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

辣根过氧化物酶

测定波长

显色反应

底 物

酶

ELISA的种类和变化

(一)双抗体夹心法

(二)间接法

(三)竞争法

(四)双位点一步法

(五)捕获法测IgM抗体

(六)应用亲和素和生物素的ELISA

(一)双抗体夹心法

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原

获得待分析物的未标定抗体

将特异性抗体与固相

载体连接形成固相抗体

洗涤除去未结合的

抗体及杂质

加入封闭蛋白溶液以封闭载体

表面残留的蛋白结合位点

洗涤并除去未结合的封闭蛋白

加受检标本(抗原)形成

固相抗体-抗原复合物

洗涤除去其他

未结合的物质

加酶标抗体生成

抗体—待测抗原—酶标记抗体

的复合物

彻底洗涤

未结合的

酶标抗体

加底物进行

酶催化反应

根据颜色反应的

程度进行该抗原

的定性或定量测定

间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.

(二)间接法

包被固相载体:

用已知抗原包被

固相载体

加待检标本:

使相应抗体与固相抗原结合

洗涤,除去无关的物质

加酶标抗抗体:

与固相载体上抗原抗体

复合物结合;洗涤,除去

未结合的酶标抗抗体

加底物

显色

根据颜色反应的程度进行

该抗原的定性或定量测定

(三)竞争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体 .

用已知特异性

抗体包被

固相载体

测定管加待测抗原和

一定量的酶标抗原使二者与

固相抗体竞争结合

对照管只加一定量酶标抗原

与固相抗体直接结合

分别洗涤

除去未结合

的成分

加底物显色

分别测定两管的吸光度值,

根据对照管与测定管吸光度值之比,

计算标本中待测抗原含量

对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异.如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少.因此,加入底物后显色反应较弱.

特点一:灵敏性

该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶.众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ,产生可供观察的显色反应现象.因此该体系常被称为酶放大体系.ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳克水平上对其进行定量.

例如,在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml .

特点二:特异性

其特异性来自抗体或抗原的选择性.抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间.由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性.

例如乙肝中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应.抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物.

ELISA应用实例

饲料中盐酸克伦特罗的测定

饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 )

饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )

甲胺磷残留分析

甲基对硫磷残留分析

呋喃丹残留分析

ELISA在饲料安全检测中的应用

ELISA用于农药残留的检测

河豚毒素

植物毒素如**碱,,藻类毒素

苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类

例如杀暝松( FN ),

甲氟磷酸异已酶( SOMAN ),

草不绿( Alachor ),

西维因( Carbaryl ),

多菌灵及克菌丹( Captan )等.

农药的检测:

ELISA检测 "非典型肺炎"冠状

ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体

ELISA在疾病诊断中的作用

ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

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酶联免疫井

DNM-9602G酶标分析仪

DNM-9602 标配酶标分析仪

DNM-9602A酶标分析仪

几种酶标分析仪

(一) 原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二 用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(三) 试剂器材

1. 试剂

(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

NaCO3　1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml

(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml

(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。

(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。

(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl

(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl

(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。

(9) 正常人血清和阳性对照血清。

2. 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四) 注意事项

1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。